En 1567, tan solo 4 años después de iniciadas las obras de construcción de Monasterio del Escorial, ya fundó e instituyo el rey Felipe II un seminario para niños que habían de vivir en el Monasterio. Durante el período de edificación del Monasterio esta seminario se instaló en la abadía que compró el rey en Párraces (segovia) a tal efecto.
Este grupo de niños del seminario tenía como función principal cantar todos los días la misa del Alba, que se oficiaba siempre por la salud del monarca reinante en el trono español y la Salve tras el rezo de vísperas. Además de cantar esta misa, por los cantorales que para ellos se compusieron, también participaban en las principales fiestas litúrgicas, así como en los recibimientos a los reyes y otros personajes ilustres en el Monasterio, donde danzaban y representaban comedias para entretenimiento de la Familia Real.
Desde sus inicios el rey se preocupó de que estos niños recibiesen una buena educación y así estudiaban gramática y latinidad, música y canto llano y, por supuesto, no se descuidaba que los niños adquirieran buenas y cristianas costumbres.
A la vez que estos niños del Seminario existió otro grupo de niños, entre 4 y 8 según épocas, que debían tener buena voz para cantar las voces agudas en la Capilla de Música del Monasterio en señalados días festivos.
La institución del Seminario se mantuvo hasta la desamortización de Mendizábal. Posteriormente, gracias a Antonio Mª Claret, capellán de la reina Isabel II, se restituyó el colegio de niños, creando dentro de él una serie de becas para los muchachos que habían de formar parte del coro; es decir la Escolanía.
En 1974, ya con los religiosos agustinos al frente del Monasterio, se procedió a la refundación del coro de niños cantores de la mano del P. Vicente Gómez Mier, por aquél entonces Provincial de los Agustinos del Escorial, y del P. Pedro Blanco, que desempeñó la función de Director de la Escolanía durante un largo período de tiempo.
En la actualidad son 47 los niños cantores que componen la Escolanía. Residen en el mismo Monasterio del Escorial y son atendidos por la comunidad de religiosos agustinos y otros profesores especialistas en música. Para su formación académica asisten como alumnos becados al Real Colegio Alfonso XII.
Cada año son seleccionados un grupo de doce niños de entre los que se presentan para ocupar alguna de las plazas vacantes, y tras un examen de sus cualidades y aptitudes son becados para proseguir su formación en el Monasterio del Escorial, donde reciben una esmerada formación humana, académica y musical a la vez que tienen la suerte de poder residir en tan singular edificio.
La función principal de estos niños es la de solemnizar el culto que tiene lugar en la Real Basílica, participando en las principales funciones litúrgicas del año (Navidad, Semana Santa, San Lorenzo), así como en  las numerosas ocasiones en que tiene lugar algún acto de Estado en el Real Sitio, o en los relacionados con la Casa Real Española o la Real y Militar Orden de San Hermenegildo.
Son numerosas las grabaciones que han realizado, entre las que destacan algunas obras rescatadas del importantísimo archivo musical que se guarda en la Biblioteca Real del Monasterio. En esta línea se encuentran tres de sus últimas grabaciones, dos en su colección Maestros del Escorial (en el sello DIES), conteniendo obras del primer músico que llevó Felipe II al Monasterio o de otros importantes Maestros de Capilla; y otra con obras de Soler (esta grabación en el sello Glossa).
Todos los sábados se puede escuchar a estos Niños Cantores en la Misa vespertina de las 19:00 así como en la Salve que cantan tras la celebración. Y los Domingos a las 13:00. También en los numerosos conciertos que ofrecen por toda la geografía española. Es tradicional su concierto cada 23 de Diciembre en San Lorenzo del Escorial, donde cada año felicitan la Navidad con una selección de villancicos; o el ciclo de conciertos que ofrecen cada año a las puertas de la Semana Santa.